基本介绍
微生物核糖体小亚基SSU rRNA 可变区的测序分析方法被广泛应用于环境微生物多样的研究，16S rRNA 基因、18S rRNA 基因和ITS 基因也是进行系统发育和分类研究时最常用的分子标记物。近年来，随着高通量测序技术及数据分析方法的不断进步，大量基于扩增子测序技术的研究在微生物生态学中得到了迅速的发展。但限于Illumina 平台的短片段测序长度的限制，基于该平台对部分高变区的测序分析很难将物种精确鉴定到属以下的分类水平。
罗宁生物基于Nanopore平台 测序技术的超长读长优势，开发了覆盖全长核糖体小亚基16S rRNA 基因、18S rRNA 基因和ITS 基因的高通量测序分析技术，解决了Illumina 平台短读长的只能针对部分可变区进行分析的技术难题，在最优成本的基础上，实现了菌群分类的精准鉴定。与此同时，基于 Reads 的原始错误矫正，可获取精确度在99% 以上的全长序列。
16S rRNA 基因序列组成及引物选择
原核生物的16S rRNA基因全长9个高变区，可通过Nanopore平台进行全长测序，完全实现精确到“种”的分类水平。
ITS 基因结构示意图及引物选择
真核微生物可进行18S和ITS或独立区域的全长测序进行微生物群落结构分析，即使ITS测序也可精准定位到种水平。
微生物核糖体小亚基SSU rRNA可变区的测序分析方法被广泛应用于环境微生物多样的研究，16S rRNA基因、18S rRNA基因和ITS基因也是进行系统发育和分类研究时最常用的分子标记物。近年来，随着高通量测序技术及数据分析方法的不断进步，大量基于扩增子测序技术的研究在微生物生态学中得到了迅速的发展。但限于Illumina平台的短片段测序长度的限制，基于该平台对部分高变区的测序分析很难将物种精确鉴定到属以下的分类水平（含GSS项目）。
罗宁生物基于Nanopore单分子实时测序技术的超长读长优势，开发了覆盖全长核糖体小亚基16S rRNA基因、18S rRNA基因和ITS基因的高通量测序分析技术，解决了Illumina平台短读长的只能针对部分可变区进行分析的技术难题，在最优成本的基础上，实现了菌群分类的精准鉴定。与此同时，基于Reads的原始错误矫正，可获取精确度在99%以上的全长序列。
测序策略
建库 测序 分析指标 对环境样本基因组 DNA 进行 16S/18S/ITS/ 功能基因（均可采用 GSS 测序）进行全长线性期扩增， Nanopore原装试剂 建库。 获取扩增子全长序列，每个样本约 10000-100000 条 read 建库测序：5个工作日
数据分析：5-10个工作日
生物信息分析
根据样本进行最大化分析，最多可获得84项分析结果，完美解析样本信息。
为了更好的体现全长 16S/18S/ITS/ 功能基因在微生物群落多样性分析方面的准确度，通过使用ZymoBIOMICS™ Microbial Community Standards作为标样，分别进行二代和三代测序分析，对OTU进行聚类分析。该标准样本中供含有8株细菌和2株酵母。从全长16S的聚类结果来看较为真实的反映了该样本的多样性，但是基于短读长的分析结果显示其与实际情况差异较大。
[案例一] Improved OTU-picking using long-read 16S rRNA gene amplicon sequencing and generic hierarchical clustering
研究方法
相同的人肠道样本进行16S分析：Miseq对V3-V4区进行测序；PacBio SMRT数据直接读取和分析。
研究结果
1、CCS Reads在准确度上与Hiseq上相当；
2、PacBio全长测序有更多的OTU被鉴定出来。
因此，当测序读长覆盖到更多可变区时，能够检测到更加真实的微生物群体多样性组成。
[案例二]High-resolution phylogenetic microbial community profiling
Doi:10.1038/ismej.2015.249
研究方法：
样本来源：23种细菌和3种古菌组成的人工菌群，以及取自湖水的天然微生物群落样本
测序平台：PacBio RS II（16S rRNA基因全长）+Illumina MiSeq（16S rRNA基因V4区）
对两种测序平台的测序结果进行多样性组成谱分析，并通过计算机模拟，比较16S rRNA基因全长序列和单V区序列的物种分辨能力。
研究结果：
基于PacBio和Illumina测序 平台的结果，门水平的菌群组成相似度较高，但在更精细的分类水平存在较大差异。同时，PacBio三代测序的结果显著降低了物种分类信息的不确定性。计算机模拟的结果也表明，短读长的单V区测序可能严重低估某些特定类群的微生物，比如水体样本中参与氮循环和甲烷代谢的物种。因此，基于三代测序的菌群多样性组成谱分析能极大地提升物种分类鉴定的精确性，实现“高分辨率”检测的同时，也为深入阐释菌群的代谢功能奠定了基础。
两种测序平台测序结果的整体比较。两者菌群的整体结构较为相似，但当菌群复杂程度增加时（图C），两者的检测结果有所差异。PhyloTags，三代PacBio RS II测序结果；iTags，Illumina MiSeq测序结果。
16S rRNA 基因各V区的序列保守性并不一致，因而基于16S rRNA 基因全长序列的三代测序，可以更全面地反映物种的种属信息。图 a ，以Salmonella 属为代表，全长序列的种间差异达到97.4%，但V4区高度保守，二代测序结果将低估该物种的多样性；图b ，某些物种在V4区的多样性可能高于其他V区，因而二代测序结果将高估相关物种的多样性。
两种测序平台测序结果的精细比较。图 a ，三代测序的结果显著降低了物种分类信息的不确定性；b图，二代单V区测序结果可能会严重低估某些特定微生物类群的含量（以方框标记）。
两种测序平台测序结果的精细比较。图a，三代测序的结果显著降低了物种分类信息的不确定性；图b，二代单V区测序结果可能会严重低估某些特定微生物类群的含量（方框标记）。
Improved OTU-picking using long-read 16S rRNA gene amplicon sequencing and gener
Oscar Franzen,et al.2015. I mproved OTU-picking using long-read 16S rRNA gene amplicon sequencing and generic hierarchical clustering.Microbiome.
Singer, E., Bushnell, B., Coleman-Derr, D., Bowman, B., Bowers, R.M., Levy, A., Gies, E.A., Cheng, J.-F., Copeland, A., Klenk, H.-P., et al. 2016. High-resolution phylogenetic microbial community profiling. ISME J 10, 2020-2032.
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