材料与方法
样品来源
实验共有103个样品，这些样品来自两个不同的群体：出生2-11周的8个早产婴儿粪便样品（微生物组成相对简单）；出生13-19个月的6个幼儿粪便样品（较早产婴儿微生物组成复杂）。
实验设计
本研究主要比较5种条件下微生物的差异：①提取：不同人员、不同试剂盒；②不同取样重量：20、50、100、200mg；③冻存时间；④室温保存；⑤邮寄。具体实验设计如下表所示：
16S测序，对V3-V5区测序采用454 FLX platform， 对V4区测序采用Illumina Miseq platform。
研究成果
1. 提取对微生物的影响
同一样品，经不同人在不同时期采用不同批次试剂盒提取后，微生物多样性无显著差异。
图1 PCoA分析
a. Weighted UniFrac, b. Unweighted Unifrac, c. Bray-Curtis dissimilarity, d. Jaccard dissimilarity红点（DNA extraction 1，-80℃冻存24天）和蓝点（DNA extraction 2，-80℃冻存115天）表示同一个样品分为10份，经不同人采用不同批次试剂盒提取后检测微生物多样性，无显著差异；其他点表示保存不同时间后微生物多样性。
2. 样品提取用量对微生物的影响
一般线性模型分析（general linear models，GLMs）表明：alpha多样性与样品质量无显著相关性（图2）；同时，beta多样性指数与样品质量也无显著相关性，但是与50mg样品相比，200mg样品的weighted UniFrac指数较高。Weighted UniFrac distances和Bray-Curtis dissimilarity结果显示：同一来源的不同质量样品之间更相似（图3）。
图2 alpha多样性与样品质量之间的关系
图3 四个样品不同质量beta多样性分析
3. 长期冻存对微生物多样性的影响
四个多样性指数与冻存时间之间存在相关性，并且只有observed OTUs随着冻存时间的增加而减少（p=0.018）。GLMs分析结果表明beta多样性与长时间冻存之间无显著相关性。四个样品（早产婴儿5、6、7、8）中，有三个样品在冻存24个月后weight UniFrac distances偏高，说明这些样品中微生物丰度发生变化。通过GLMs分析，共发现8种微生物（Lactobacillus1、Lactobacillus2、Bacilli、Enterobacteriaceae、Gammaproteobacteria1、Enterococcus2、Staphylococcus1和Staphylococcus2）发生显著变化。图5结果表明，冻存2个月的样品中OTUs与其他月的样品OTUs相比无显著差异。
图4 alpha多样性与冻存时间之间的关系
图5 冻存时间与样品中微生物OTUs的关系
在alpha多样性指数中，只有Shannon index随时间显著降低（图6）。在beta多样性指数中（图7），对于群落结构简单的样品，从第4h开始，随着时间延长，unweighted UniFrac distances增加（p=0.038）；对复杂群落结构的样品，所有beta多样性指数都随着时间延长而增加。
图6 室温保存时间与微生物alpha多样性的关系
图7 室温保存时间与微生物beta多样性的关系
室温保存条件下，随着保存时间的延长，在门水平上，复杂微生物群落样品中厚壁菌门显著降低（p=0.004），变形菌门显著升高（p=0.018），而放线菌门微生物丰度在两种不同样品中都降低（p=0.013和0.033），校正后，只有厚壁菌门微生物丰度存在显著差异（图8）。
图8 室温条件下微生物群落结构变化
i) 简单微生物群落样品（早产婴儿）；ii）复杂微生物群落样品（足月生产幼儿）。5. 粪便样品邮寄对微生物的影响
对三组样品进行比较：①邮寄样品；②室温下保存4h、然后-80℃保存的样品；③一直室温下保存样品。其中邮寄样品和一直室温下保存样品alpha多样性无显著差异，各OTUs及门水平丰度变化差异不显著；室温下4h、然后-80℃保存的样品与其他两组样品beta多样性无显著差异。
研究结论
-80℃保存样品2年对微生物群落结构的影响较小，只对其中部分微生物如Lactobacillus和bacilli等影响显著；
室温下放置2天就会对微生物群落产生显著影响，所以应在两天内处理或者放在-80℃保存；运输时要充分考虑到运输时间；
DNA提取人员与提取试剂批号对微生物群落结构的影响不显著；
对于微生物多样性较低的样品，减少样品提取用量对alpha多样性和一些beta多样性的影响不显著；但是低样品质量会影响weight beta多样性，同时对OTUs丰度影响显著。
亮点
本研究基于16S测序，探究了多种因素（提取方式、保存时间、保存方法、运输、样品量）对微生物多样性的影响，对我们如何处理及保存样品具有重要指导意义。