16S扩增子测序与PICRUSt分析，将成为研究新趋势

1. 先根据已测微生物基因组的16S rRNA基因全长序列，推断它们的共同祖先的基因功能谱；

2. 对Greengenes数据库中其它未测物种的基因功能谱进行推断，构建古菌和细菌域全谱系的基因功能预测谱；

3. 最后，将测序得到的菌群组成“映射”到数据库中，对菌群代谢功能进行预测。该步骤具体通过以下方式实现：

i. 对测序获得的16S rRNA基因序列，进行“封闭式”参考OTU划分（Closed-reference OTU picking），通过与Greengenes数据库比对，寻找每一条测序序列的“参考序列最近邻居”，并归为参考OTU；

ii. 根据“参考序列最近邻居”的rRNA基因拷贝数，对获得的OTU丰度矩阵进行校正；

iii. 根据“参考序列最近邻居”对应的KEGG/EggNOG等基因功能谱数据，换算预测菌群的整体代谢功能。

2、ICRUSt的特点

PICRUSt算法的一大特点，就是基于Greengenes的16S rRNA基因全长序列数据库，对菌群测序结果进行“封闭式”参考OTU划分。PICRUSt开发者对古菌和细菌域的大多数模式微生物的功能进行预测，让人欣喜的是，绝大多数的微生物预测结果与真实的基因功能谱非常接近（古菌预测精确度为0.94 ± 0.04，n = 103；细菌为0.95 ± 0.05，n =2487）。也就是说，绝大多数情况下，PICRUSt的预测效果可靠性较高。

     当然，若测序序列与Greengenes数据库中没有同源物种的参考序列，则对应的物种将无法被预测。也就是说，原始数据在分析过程中会有一定损失。此外，PICRUSt的特点也表明，它只能对已知微生物的已知功能进行功能预测，所以目前并不能完全代替宏基因组研究，但可以看作宏基因组研究的“近似”结果，在经费、资源有限的情况下，不失为一种理想的选择。

3、PICRUSt的应用

PICRUSt对于菌群研究贡献极大。首先，PICRUSt能从菌群组成数据解读潜在的功能，可谓充分发挥了16S rRNA基因测序简单、快速、物美价廉的优势；其次，PICRUSt对菌群功能的预测，可以帮助指导后续宏基因组Denovo鸟枪法测序的实验设计，更合理地筛选用于后续研究的样本。

同时，PICRUSt分析的操作相当便捷，只需对测序数据进行“封闭式”参考OTU划分，并将得到的OTU丰度矩阵上传至Galaxy在线分析平台（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root?tool_id=PICRUSt_normalize），按提示操作就能得到预测结果。

4、16S+PICRUSt，研究新趋势

PICRUSt这一方法横空出世后，已有越来越多的研究开始采用这一方法预测菌群组成数据，相关论文发表数量逐年增长，表明该方法已得到大家广泛的认可。16S+PICRUSt，已成为发表高水平论文的必备技能；同时与宏基因组分析相比，更方便快捷，成本也更低。

2016年发表在微生态学旗舰期刊《TheISME Journal》的《Cigarettesmoking and the oral microbiome in a large study of American adults》^[2]中，作者就通过PICRUSt预测了吸烟人群和未吸烟人群的口腔菌群，发现共有83个基因功能代谢通路存在显著差异，吸烟大大降低了碳水化合物和能量代谢、异型生物质降解等代谢通路的含量。

5、结语

PICRUSt虽然厉害，但并不是万能，一方面由于它是基于16S rRNA基因的参考序列库，因此尚无法对真菌群落进行功能预测，而预测过程也会造成原始数据的部分损失，对于不同来源的菌群的预测效果也有所差异（一般对于人源微生物组的预测效果最好）；同时，它并不能完全代替宏基因组研究（目前只能对已知微生物的已知功能进行功能预测），但可以对后续实验设计作出指导。

参考文献

1.Langille MGI, Zaneveld J, Caporaso JG, McDonald D, Knights D, et al. (2013)Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA markergene sequences.NatureBiotechnology31: 814-+.

2. Wu J, Peters BA, DominianniC, Zhang Y, Pei Z, et al. (2016) Cigarette smoking and the oral microbiome in alarge study of American adults.ISME J10.1038/ismej.2016.37.