一年一度测序季，16S引物如何选？

16S rDNA测序是指对环境样本16SrDNA 高变区进行PCR扩增及高通量测序的一种技术，可对特定环境下细菌和古菌的微生物种类和丰度进行有效的鉴定。16S序列由9个高变区（V区）和10个保守区组成，是最常用的细菌分类标准，通过提取环境样品的DNA，并扩增其中16S rDNA基因；通过检测16SrDNA的序列变异和丰度，反映环境样本中细菌的分类和丰度。

16S rDNA序列可以用来鉴定绝大多数细菌。基于Illumina Miseq/Hiseq平台的16S rDNA测序可以一次性完成多个样本的平行测序，提供环境样本物种分类，物种丰度，种群结构，系统进化，群落比较等诸多信息。至于物种分类，对单个高变区测序已足够，不必对16SrDNA全长进行测序。16SrRNA基因不同区域的保守度是不一样的，因此扩增区域的选择会影响多样性的分析结果。

      根据现有研究，众多学者已从多方面对引物的选择进行了较为详尽的分析，主要有引物长度、扩增长度选择、引物覆盖度等（表1）。Cai 等发现污泥微生物多样性分析与扩增区域有很大的关系，测序深度会影响低丰度细菌的鉴定。通过使用27F/338R(V1-V2) 引物对在土壤的研究中发现Verrucomicrobia类群在研究的土壤中数量相对较少，但改用515F /806R引物后，发现土壤中该类群的丰度变大，更接近于实际情况^[15]。理想的引物是能够尽量多地将环境样品中的基因扩增出来，同时又要能够区分出不同的种属。为了提高对环境样品DNA 扩增的覆盖度，可以设计简并性通用引物，即使这样，也不能覆盖所有的菌群^[16]，而且，增加位点的非特异性可能会增大扩增偏差的概率。表2列出了目前学术界在环境微生物项目中最常用的16S rDNA基因的引物对，不同的引物对不同种属的覆盖度不一样。

      有的学者建议细菌与古菌群落应该分别使用细菌或古细菌特异引物进行分析^［14］，但也有学者直接使用细菌与古菌的通用引物对进行分析^［9,10］。因此，在试验设计时需要考虑到试验目的而有针对性地进行选择，对不同的通用引物的覆盖能力要有个大致的了解。利用Illumina Miseq测序平台，其测序长度在500-600bp（含Barcode有效长度400-500bp）之间，为了得到更多有效数据量，我们一般选择200-400bp左右的扩增子进行测序。

目前V3-V5 区引物对应用较多，从表1和表2数据可以看出，在细菌物种鉴定方面，使用位于V4区的U/E515F引物的覆盖度达到99%-99.1%，与此同时下游引物E806R的覆盖度也达到了95.10%；根据试验目的的不同，如下游引物使用U909R则会检出更大比例古菌。因此，选择U515F/U806R引物对在细菌检出率上具有绝对的优势。同时，该引物对扩增子平均长度为291bp，相较于使用V3-V5区引物E341F/U909R或U341F/E785R扩增子566bp和444bp来说长度更短，在短片段测序具有更大优势的Illumina测序平台来说，更小的扩增子测序引入的测序误差更低，Q值更高，测序结果更加真实可靠。因此，U515F/U806R引物对的使用更能真实反映细菌群落结构的信息。

表3.16S扩增子引物序列

随着测序技术的发展和环境微生物扩增子研究的不断进步，Parada等学者发现传统的U515F/U806R引物对会对海洋中SAR11群落的检测造成低估，同时对γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）造成高估，因此他们对传统U515F引物的一个兼并碱基做了改进，并结合U926R引物，对海洋中的微生物多样性进行了检测，发现改进后的U515F引物可以有效地改善扩增偏好性。越来越多的学者想要在有限的经费内获得更多覆盖面更全的序列信息，于是Apprill等学者在U515F改善的基础上，进一步改善了E806R端，相比原先的E806R端其覆盖面更广了（表3中U515F-M/E806R-M引物对为改进后引物，目前罗宁生物在原有引物的基础上免费提供改进引物对扩增）。因此对于环境样本而言，使用改进后的U515F/E806R或U515F/E926R，可能在行业标准日益规范的今天，是一个更好地选择，今后应该会成为16S检测微生物多样性测序的首选。更多信息请点击参阅16S扩增子测序项目介绍。

参考文献

[1] BakerGC, Smith JJ, Cowan DA (2003) Review and re-analysis of domainspecific 16Sprimers Journal of Microb Methods,55: 541–555.

[2] HuwsSA, Edwards JE, Kim EJ, ScollanND (2007) Specificity andsensitivity of eubacterial primers utilized for molecular profiling of bacteriawithin complex microbial ecosystems Journal of Microbiol Methods,70:565–569.

[3] LiuZ, Lozupone C, Hamady M, Bushman FD, Knight R (2007) Short pyrosequencing readssuffice for accurate microbial community analysis. Nucleic Acids Research,35:e120.

[4] TeskeA, Sorensen KB (2007) Uncultured archaea in deep marine subsurface sediments:have we caught them all The ISME Journal, 2: 3–18.

[5] StultsJR, Snoeyenbos-West O, Methe B, Lovley DR, Chandler DP (2001) Application ofthe 59 fluorogenic exonuclease assay (TaqMan) for quantitative ribosomal DNAand rRNA analysis in sediments. Appl Environ Microbiol,67: 2781–2789.

[6]Zakrzewski M, Goesmann A, Jaenicke S, Jünemann S, EikmeyerF, Szczepanowski R, Al-Soud WA, Srensen S, Puhler A, Schluter A. (2012) Profilingof the metabolically active community from a production-scale biogas plant bymeans of high-throughput metatranscriptome sequencing Journal of Biotechnology,158(4): 248-258.

[7] CaporasoJG, Lauber C L, Walters W A, Berg-Lyons D, Lozupone CA, Turnbaugh PJ, Fierer N,Knight R. (2011) Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millionsof sequences per sample.  Proceedingsof the NationalAcademyof Sciences of the United  States of America, 108(S1) :4516-4522.

[8] TamakiH, Wright CL, Li X, Lin Q, Hwang C, Wang S, Thimmapuram J, Kamagata Y, Liu W T., (2011) Analysis of 16S rRNA amplicon sequencing options on the roche/454 next-generationtitanium sequencing platform PloS One, 6(9) : e25263.

[9] WangY, Qian PY. (2009) Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes andprimer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PloS One，4( 10) : e7401.

[10] KlindworthA, Pruesse E, Schweer T, Peplies J, Quast C, Horn M, Glockner FO. (2013) Evaluationof general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generationsequencing-based diversity studiesNucleic Acids Research, 41(1): e1.

[11] NossaCW, Oberdorf WE, Yang L, Aas JA, Paster BJ, Desantis TZ, Brodie EL, Malamud D, PolesMA, Pei Z.  (2010) Design of 16S rRNAgene primers for 454 pyrosequencing of the human foregut microbiome WorldJournal of Gastroenterology，16( 33) :4135-4144.

[12]  Mao Y, Yannarell AC, Mackie RI. (2011)Changesin N-transforming archaea and bacteria in soil during the establishment ofbioenergy crops PloS One, 6( 9) : e24750.

[13] FrankKL, Rogers DR, Olins HC, Vidoudez C, Girguis PR. (2013) Characterizing thedistribution and rates of microbial sulfate reduction at Middle Valleyhydrothermal vents The ISME Journal, 7(7) : 1391-1401.

[14]Pinto AJ, Raskin L. (2012) PCR biases distort bacterial and archaeal communitystructure in pyrosequencing datasets.  PloS One, 7(8) : e43093.

[15]Justin K, ChristianLL, William AW, Laura WP, Jose CC, Dirk,G Rob.(2012) Experimental andanalytical tools for studying the human microbiome Nature Reviews Genetics.1(13):47-57.

[16]Hong S, Bunge J, Leslin C, Jeon S, Epstein SS. (2009).Polymerase chain reaction primers miss half of rRNA microbial diversity TheISME Journal, 3(12) : 1365-1373.